Étude de la bioactivité des acides oligo‑galacturoniques insaturés produits à partir de déchets de pomme par les pectinases Alcaligenes faecalis AGS3 et Paenibacillus polymyxa S4

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 15830 (2022) Citer cet article

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La pectine est l'un des principaux composants structurels des fruits et une fibre indigeste constituée d'unités d'acide d-galacturonique avec une liaison α (1-4). Cette étude examine la dégradation microbienne de la pectine dans les déchets de pomme et la production de composés bioactifs. Dans un premier temps, les bactéries dégradant la pectine ont été isolées et identifiées, puis l'activité pectinolytique a été évaluée par DNS. Les produits ont été évalués par CCM et LC-MS-ESI. Les effets antioxydants ont été étudiés à l'aide de DPPH et les effets anticancéreux et la cytotoxicité ont été analysés par MTT et cytométrie en flux. Dans cette étude, deux nouveaux isolats bactériens, Alcaligenes faecalis AGS3 et Paenibacillus polymyxa S4 avec l'enzyme pectinolytique ont été introduits. L'analyse de la structure a montré que les produits de la dégradation enzymatique comprennent des acides mono, di, tri et penta galacturoniques insaturés avec 74 % et 69 % de RSA à 40 mg/mL pour A. faecalis et P. polymyxa S4, respectivement. Les résultats des propriétés anti-tumorales sur les cellules MCF-7 par dosage MTT, pour les produits d'AGS3 et S4 à 40 mg/mL après 48 h, ont montré respectivement 7 % et 9 % de survie. Dans l'évaluation par cytométrie en flux, les composés d'AGS3 à 40 mg/mL étaient létaux à 100 % en 48 h et l'isolat S4 a causé 98 % de décès. L'évaluation de la cytotoxicité sur les cellules L-929 n'a montré aucune toxicité significative sur les cellules vivantes.

À mesure que la population de la Terre augmente, l'augmentation de la production alimentaire pour répondre aux besoins nutritionnels a toujours été l'une des principales préoccupations des sociétés humaines. Cette augmentation de la production, conjuguée à des facteurs tels qu'une urbanisation anarchique et l'absence de méthodes appropriées de gestion et de recyclage des déchets, conduit à l'accumulation de déchets dans l'environnement, ce qui provoque des dommages irréversibles à l'environnement1. Selon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO), la production mondiale de fruits et légumes dépasse 1,74 milliard de tonnes, dont 10 à 50 % sont gaspillés dans différents pays. La valeur du gaspillage alimentaire dans le monde est estimée à 1 000 milliards de dollars par an. Les ressources utilisées pour produire cette quantité de nourriture gaspillée sont responsables de l'émission de 4,4 gigatonnes de gaz à effet de serre (équivalent CO2) par an, faisant du gaspillage alimentaire le troisième producteur mondial de gaz à effet de serre après la Chine et les États-Unis2.

L'ampleur des pertes alimentaires varie à différents stades de la chaîne de production en fonction du type de produit, du niveau de développement économique et des conditions sociales et culturelles d'une zone géographique. Dans le cas des fruits et légumes, selon l'étude de la FAO, le gaspillage aux étapes de la récolte, du tri et du calibrage est prédominant dans les zones industrielles. Dans les zones en développement, alors que les pertes de nourriture sont élevées pendant les étapes de récolte, de tri et de classement, la quantité de gaspillage pendant l'étape de transformation (14-21 %) est beaucoup plus élevée que dans les zones développées (moins de 2 %)2,3. C'est alors que la plupart des produits fruitiers sont transformés avant consommation, donc en plus d'augmenter la valeur, maintient également la qualité et le nombre de fruits sur le marché4. De grandes quantités de déchets sont accumulées pendant le traitement, ce qui impose des coûts élevés pour les traitements afin de réduire les dommages environnementaux5,6. Ainsi, les déchets de transformation des fruits représentent non seulement des quantités importantes de déchets alimentaires, ce qui signifie de graves dommages environnementaux, mais indiquent également la perte de nutriments de grande valeur7. Par conséquent, la conversion des déchets en produits à valeur ajoutée est importante et nécessaire pour améliorer la durabilité et l'efficacité de la chaîne d'approvisionnement alimentaire8.

Au fil des ans, dans de nombreuses études, la production de produits à valeur ajoutée, par conversion microbienne ou processus enzymatiques de déchets de fruits tels que les enzymes, le bioéthanol, les acides organiques, les hétéropolysaccharides, les composés aromatiques, les aliments enrichis en protéines, les oligosaccharides prébiotiques et les composés bioactifs , a fait l'objet d'une enquête9. Le traitement microbien des fibres de fruits résiduelles est une approche relativement nouvelle qui utilise les déchets comme monomères pour la synthèse d'oligomères bénéfiques naturels10.

En général, la structure du fruit est composée de divers composés aux propriétés différentes. Après l'eau, la plus grande abondance appartient aux glucides, qui représentent 50 à 80 % du poids sec de la plupart des fruits11. Un grand nombre de glucides contenus dans les déchets de fruits sont des types de fibres alimentaires, dont la pectine représente jusqu'à 40 % des composés12. Les pectines sont une famille de polysaccharides acides de haut poids moléculaire, qui sont abondants dans la paroi cellulaire primaire des plantes, fabriqués principalement à partir d'unités d'acide d-galacturonique dans la chaîne principale avec une liaison α (1-4) avec de petites quantités de rhamnose dans la chaîne principale et arabinose, galactose et xylose dans les chaînes latérales10,13. Plusieurs études ont démontré les applications de la pectine dans les industries alimentaires et pharmaceutiques. Des études ont suggéré que les pectines à chaîne courte ont des applications plus larges, telles que les prébiotiques, les agents anticancéreux, les systèmes d'administration de médicaments, les propriétés de piégeage des radicaux, la réduction du cholestérol, etc., et ces caractéristiques sont liées à la structure et au poids moléculaire des composés pectiques10 ,14.

Les espèces radicales sont associées à la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), à l'asthme, au diabète, à l'inflammation, aux maladies cardiovasculaires et à l'infarctus du myocarde. Les antioxydants synthétiques couramment utilisés dans les procédés de fabrication sont considérés comme la cause de la cytotoxicité. D'autre part, les polysaccharides naturels sont considérés comme des antioxydants fiables capables de piéger les radicaux libres et de surmonter les substances synthétiques qui posent des problèmes de santé. Les composés riches en rhamnogalacturonan I ainsi que les composés constitués d'homogalacturonan dans la chaîne principale et de rhamnogalacturonan I et d'arabinogalactane dans les chaînes latérales présentent le plus haut niveau de propriétés antioxydantes ; Par conséquent, les propriétés antioxydantes des composés pectiques peuvent être attribuées à la structure du rhamnogalacturonan I, de l'homogalacturonan et de l'arabinogalactan15. Les acides oligogalacturoniques dérivés de la pectine, modifiés par divers traitements, peuvent également purifier des composés, notamment des anions superoxyde, hydroxyle et des espèces réactives de l'oxygène. Ils augmentent également les propriétés antioxydantes des enzymes : superoxyde dismutase, catalase et glutathion peroxydase et présentent des propriétés antioxydantes en augmentant la quantité de glutathion16.

Une autre activité biologique prometteuse de la pectine est son rôle potentiel dans la prévention et la réduction de la carcinogenèse. Les effets positifs de la "pectine modifiée", que ce soit sous la forme de produits commerciaux tels que la pectine d'agrumes modifiée (par exemple GCS-100, FPP ou pectasol) ou la pectine modifiée en laboratoire, ont été étudiés et prouvés. La pectine modifiée aux agrumes (MCP) en particulier a fait et fait l'objet de recherches approfondies17. Tous les MCP ne sont pas identiques car le terme est utilisé pour décrire les polysaccharides solubles dans l'eau dérivés de la pectine produite à partir de zeste et de pulpe d'agrumes traités à haute température, à pH élevé ou par décomposition enzymatique. La pectine d'agrumes à pH modifié a un poids moléculaire réduit et est dérivée de la pectine d'agrumes commerciale et possède des chaînes latérales riches en galactose capables de se lier à la protéine prométastatique galactine-3 et d'inhiber les métastases des cellules tumorales. La galactine-3 joue un rôle clé dans plusieurs processus physiologiques et pathologiques intracellulaires, notamment la prolifération des cellules tumorales et l'apoptose. La liaison du MCP à la galactine-3 peut inhiber les effets négatifs de la galactine-3, comme l'inhibition de sa capacité à favoriser l'adhésion et la migration des cellules tumorales et à prévenir l'apoptose. En plus des chaînes latérales riches en galactose, la partie homogalacturonane de la pectine a également une activité anticancéreuse. Des fragments de pectine de faible poids moléculaire (1 kDa) riches en acide galacturonique ont été absorbés par des cellules cancéreuses de souris et humaines, ce qui a inhibé la croissance de ces cellules et conduit à la libération de lactate déshydrogénase et de galactine-3. En plus de l'interaction avec la galactine-3, certains autres effets anticancéreux potentiels des pectines modifiées ont été signalés dans des conditions in vitro et in vivo18. La poudre de pectine fractionnée d'agrumes de faible poids moléculaire (FPP) produite par hydrolyse en autoclave ou une combinaison de chauffage et d'hydrolyse enzymatique induit également l'apoptose androgénique et androgéno-indépendante des cellules cancéreuses de la prostate. Les MCP produites par dégradation enzymatique du pectasol ont induit l'apoptose des cellules cancéreuses de la prostate et augmenté le temps de doublement de l'antigène prostatique spécifique (PSA) chez les patients subissant divers traitements utilisés pour traiter le cancer de la prostate. Il a également été démontré que la pectine d'agrumes hydrolysée par voie enzymatique présente des avantages cliniques, améliore la qualité de vie et réduit la douleur chez les patients atteints de tumeurs avancées dans divers types de cancer19.

Les pectines peuvent être dégradées en oligosaccharides pectiques (POS) par diverses méthodes de dégradation telles que l'hydrolyse enzymatique, l'hydrolyse acide, le traitement hydrothermique, la microfluidisation à haute pression ou la réaction photochimique dans un milieu contenant du TiO210,20. Les méthodes enzymatiques présentent des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes, telles que : (1) la réaction est effectuée dans des conditions de fonctionnement douces, (2) le milieu d'hydrolyse ne provoque pas de corrosion, (3) aucun produit chimique toxique ou contaminant n'est utilisé (4) l'hydrolyse est sélective et n'affecte que des unités ou des liaisons constitutives spécifiques, comme prévu pour une réaction catalysée par une enzyme ; (5) l'efficacité de la réaction peut être supérieure à celle pouvant être obtenue par des méthodes chimiques et (6) la formation de produits indésirables est évitée21. Les enzymes pectinolytiques sont classées en deux groupes principaux : (a) les estérases, y compris la pectine méthyl estérase, et (b) la dépolymérase, y compris l'hydrolase et la lyase22. De nombreuses espèces fongiques peuvent décomposer la pectine en produisant différentes enzymes pectinolytiques. Des études ont montré qu'Alternaria sesami produit des enzymes pectinolytiques, notamment des transéliminases de polygalacturonase, des transéliminases de pectine et des polygalacturonases23. Elrod a rapporté pour la première fois que la bactérie Erwinia pouvait dégrader la pectine23. Zucker et al.24 et Chatterjee et al.25 ont démontré la production d'endopolygalacturonase induite et extracellulaire par Pseudomonas fluorescens et Erwinia.

Alcaligenes faecalis, en tant que membre des Alcaligenaceae de la classe Betaproteobacteria, a de nombreuses applications dans les biotechnologies et les industries alimentaires et de la santé. Alcaligenes spp. a été utilisé dans la production de matériaux de stockage de type plastique, d'enzymes, de polysaccharides, ainsi que dans la production commerciale d'acides aminés en tant qu'additifs alimentaires26.

En tant que membre des Paenibacillaceae de la classe Bacilli, Paenibacillus polymyxa est impliqué dans une variété de processus physiologiques et biotechnologiques. Différentes souches de cette bactérie peuvent être utilisées dans la fixation de l'azote, la production d'antibiotiques et la solubilisation du phosphore dans le sol. P. polymyxa est connu pour produire des enzymes dégradant la paroi cellulaire avec des voies hydrolytiques. Il a été rapporté que différentes souches de P. polymyxa produisent des exopolysaccharides (EPS) qui, en tant que métabolite secondaire, ont un large éventail d'applications dans les bioindustries27.

Dans la présente étude, A. faecalis, AGS3 et P. polymyxa S4 ont été isolés et identifiés. L'objectif de cette étude était d'étudier la dégradation microbienne de la pectine par la pectinase des isolats bactériens isolés A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4 et pour la première fois d'identifier les produits, puis d'étudier les propriétés anticancéreuses et antioxydantes des composés obtenus.

Isole AGS3, gram-négatif, non acido-résistant, aérobie, en forme de bâtonnet, catalase-positif, oxydase-positif, citrate positif et mobile et S4 gram-positif, non acido-résistant, aérobie, en forme de bâtonnet, catalase-négatif, oxydase négatif, citrate négatif et non mobile (Fig. 1b) ont été sélectionnés en fonction de leur rayon de zone de halo clair (Fig. 1a). Les conditions de croissance optimales pour les deux isolats étaient à 30 °C et pH 6,8–7,0. Les résultats de l'analyse phylogénétique effectuée à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance ont montré que l'isolat AGS3 appartient au phylum des Proteobacteria, à la famille des Alcaligenaceae et au genre Alcaligenes, et que S4 était un membre du phylum des Firmicutes, de la famille des Paenibacillaceae et du genre des Paenibacillus (Fig. 1c). De plus, l'analyse BLAST a révélé que les isolats AGS3 et S4 appartenaient respectivement aux espèces Alcaligenes faecalis et Paenibacillus polymyxa. Désormais, la séquence des isolats A. faecalis AGS3 (MZ093052) et P. polymyxa S4 (MZ596260) a été soumise à GenBank, The National Center for Biotechnology Information (NCBI).

( a ) Zone de halo autour d'isolats bactériens sélectionnés, AGS3 et S4, montrant une activité pectinolytique par dégradation de l'acide polygalacturonique (zones de halo jaunes). ( b ) Image microscopique des isolats bactériens AGS3 et S4. ( c ) Relations phylogénétiques entre l'isolat A. faecalis AGS3 et l'isolat P. polymyxa S4. L'arbre a été construit avec le logiciel MEGA 11 en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance avec 1000 bootstraps.

Alcaligenes faecalis est surtout connu pour sa respiration anaérobie avec le nitrite et la dégradation des polymères de réserve microbienne tels que le poly-(3-hydroxybutyrate) (PHB). A. faecalis a également été utilisé dans la production d'acides aminés non standard. Bien qu'A. faecalis soit reconnu pour avoir une variété d'enzymes hydrolytiques qui peuvent être utilisées dans la biodégradation des déchets végétaux, l'étude de son potentiel doit encore progresser26.

Paenibacillus polymyxa est reconnu pour produire une grande variété de métabolites secondaires, ce qui lui permet de résister à divers stress environnementaux et en fait un agent biotechnologique de bon augure dans les processus agricoles et industriels. P. polymyxa a la capacité de fixer l'azote, ainsi que la production de facteurs de régulation de la croissance des plantes, d'enzymes hydrolytiques et de composés antibiotiques. Les souches de P. polymyxa sont connues pour produire plusieurs enzymes hydrolytiques, notamment les protéases, les β-1,3-glucanases, les cellulases, la xylanase, la lipase, l'amylase, les chitinases et la pectinase. Par conséquent, diverses études ont examiné la capacité des souches de P. polymyxa dans la gestion des déchets et le traitement des eaux usées. Cependant, les composés produits par l'activité hydrolytique des enzymes de P. polymyxa n'ont pas encore été identifiés et nécessitent des recherches supplémentaires27.

Le test de dégradation de la pectine a été utilisé à l'aide du réactif DNS pour déterminer le nombre d'oligosaccharides pectiques (POS) produits par l'activité pectinase des isolats A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4. Les résultats de détermination du rendement le plus élevé de libération de POS ont montré que les isolats A. faecalis AGS3 (Fig. 2a) et P. polymyxa S4 (Fig. 2b) ont leur concentration maximale de sucres libérés après 20 h et 4 h d'incubation à 30° C, 180 tr/min respectivement.

Surveillance de la quantité d'oligosaccharide pectique libérée par (a) l'isolat A. faecalis AGS3 et (b) l'isolat P. polymyxa S4, dans un milieu de culture de pectine - 30 ° C 180 tr/min.

En fin de compte, les POS obtenus ont été lyophilisés et stockés pour une analyse plus approfondie.

Une chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée pour vérifier la dégradation de la pectine par les isolats. Les modèles de CCM ont confirmé la dégradation de la pectine en POS dans les deux isolats (Fig. 3a). Une analyse plus poussée des acides oligo-galacturoniques produits a été mise en œuvre par LC-ESI-MS d'échantillons lyophilisés. Les spectres de masse LC – ESI – MS des fractions de produits des isolats A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4 ont montré que différents types d'acides oligo-galacturoniques étaient présents dans les produits enzymatiques de la dégradation de la pectine dans les deux isolats (Fig. 3b, c, Tableau 1 ). Au final, des formes d'acide mono galacturonique et d'acide mono, di, tri et penta galacturonique insaturé ont été identifiées. Il existe différents types d'enzymes pectinolytiques. Parmi eux, la réaction menée par la pectine lyase produit des oligo-galacturonates insaturés. Par conséquent, compte tenu des produits obtenus dans cette étude, on suppose que l'activité pectinolytique des isolats A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4 est due à l'enzyme pectine lyase.

(a) Modèles d'évaluation CCM des échantillons obtenus à partir de l'activité pectinolytique des isolats, S1 : solution standard de glucose, S2 : oligosaccharide pectique obtenu à partir de A. faecalis AGS3, S3 : oligosaccharide pectique obtenu à partir de P. polymyxa S4, S4 : solution standard de l'acide mono-galacturonique; Spectres de masse LC – ESI – MS d'échantillons obtenus à partir de la dégradation de la pectine par (b) A. faecalis AGS3 et (c) P. polymyxa S4.

En général, la plupart des pectinases signalées appartiennent à des champignons tels que Aspergillus, Alternaria et Penicillium28,29,30,31. Néanmoins, il y a eu des rapports montrant divers types d'enzymes pectinolytiques dans les bactéries ; par exemple, Acinetobacter guillouiae, Kosakonia sacchari et Bacillus vallismortis auraient des polygalacturonases. La présence de pectine et de pectate lyases a été prouvée chez les espèces Streptomyces, Actinomycetes, Pseudomonas et Bacillus31,32. Certains agents pathogènes endophytes tels que Xanthomonas compestris, Ervinia chrysanthemi, Colletotrichum lindemuthianum, Pseudomonas siringea et Phytophthora capsici auraient une activité pectinolytique31. Des études suggèrent que certains agents pathogènes entériques, dont Salmonella et Escherichia coli, malgré leur manque d'enzymes pectinolytiques, sont capables d'utiliser des oligomères résultant de la dégradation de la pectine10,31. Nous pensons que cette étude est la première à identifier des composés obtenus à partir de l'activité pectinolytique de A. faecalis et P. polymyxa.

L'activité de piégeage des radicaux (RSA) des POS obtenus a été testée par le réactif DPPH. Les résultats pour une gamme de concentrations allant de 1,25 à 80 mg/mL ont révélé que les effets antioxydants des POS augmentent en augmentant leurs concentrations. Le RSA du POS obtenu à partir de l'isolat A. faecalis AGS3 variait de 18 à 81 % pour des concentrations de 1,25 à 80 mg/mL, et les résultats pour P. polymyxa montraient une plage de RSA de 13 à 74 % pour les mêmes concentrations (Fig. 4 ).

Évaluation des propriétés antioxydantes des oligosaccharides obtenus à partir de la dégradation de la pectine par le réactif DPPH.

Le stress oxydatif est un concept associé à la perte d'équilibre entre les pro-oxydants et les antioxydants et est lié à la physiologie des maladies courantes. Les antioxydants ont pour rôle de neutraliser les formes réactives de l'oxygène ayant un impact négatif sur les cellules vivantes33. Yeung et al.34 ont utilisé la réaction de Fenton pour hydrolyser la pectine de gombo et ont découvert que l'activité antioxydante du POS obtenu dépend de la concentration. Les résultats du dosage DPPH des POS obtenus par hydrolyse enzymatique des hydrogénases de Streptomyces YAM1 ont montré que le RSA augmente à des concentrations plus élevées. Hosseini Abari et al.10 ont également démontré que la pectine modifiée enzymatiquement a plus d'activité antioxydante que les polysaccharides pectiques non traités. Des études similaires corroborent la dose-dépendance de l'activité antioxydante des POS. Dans cette étude, comme le montre la figure 6, concernant une augmentation des propriétés antioxydantes des échantillons par concentration, le RSA le plus élevé a été signalé dans 80 mg/mL d'échantillons obtenus à partir d'A. faecalis AGS3 et de P. polymyxa S4. Dans 20 mg/mL de POS, les résultats étaient de 59 % pour P. polymyxa S4 et de 69 % pour A. faecalis AGS3, qui a montré une augmentation de 20 à 30 % du RSA, par rapport aux acides polygalacturoniques, comme mentionné dans Hosseini Abari et al. étude10. Ces résultats montrent une augmentation significative du RSA du POS par rapport aux résultats de l'activité antioxydante des polysaccharides pectiques des études précédentes. Il s'agit du premier signalement de RSA dans les produits des espèces A. faecalis et P. polymyxa.

Une évaluation réalisée par dosage MTT et cytométrie en flux a montré une activité anticancéreuse significative sur les cellules MCF-7 pour les POS obtenus à partir de déchets de pomme en utilisant les enzymes pectinolytiques des isolats P. polymyxa S4 et A. faecalis AGS3. Comme mentionné dans la Fig. 5, les résultats du test MTT ont montré une réduction maximale de la viabilité cellulaire à 40 mg/mL de POS obtenus à partir de A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4 avec respectivement 93 % et 91 % après 48 h d'incubation. Une réduction minimale de la viabilité cellulaire a été obtenue à 1,25 mg/mL de POS après 24 h de traitement avec 17 % et 37 % pour A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4, respectivement.

Évaluation MTT des cellules MCF-7 après traitement pendant (a) 24 h et (b) 48 h.

De même, les résultats de l'analyse par cytométrie en flux à 5 et 40 mg/mL des POS obtenus après 48 h d'incubation ont démontré l'induction de l'apoptose, avec 84 % et 100 % pour A. faecalis AGS3, et 90 % et 98 % pour P. polymyxa S4 ( figure 6b). Sur la figure 6b, la zone M1 représente la distribution des cellules vivantes, non colorées par le réactif PI, et la zone M2 montre les cellules mortes, colorées par le réactif PI. Comme le montre la figure 6a, les cellules traitées ont également été sujettes à des changements morphologiques.

Les résultats de viabilité cellulaire de MCF-7 après 48 h de traitement avec 5 et 40 mg/mL de POS ont obtenu A. faecalis AGS3 et P. polymyxa S4, où (a) montre les aspects morphologiques des cellules traitées par rapport aux cellules témoins (non traitées) et (b) démontre une analyse par cytométrie en flux des cellules traitées, par rapport aux cellules témoins (non traitées).

Le cancer, l'un des principaux problèmes de santé dans le monde, a de nombreux inducteurs physiologiques et biochimiques appelés cancérigènes. La majorité des médicaments synthétiques utilisés dans les traitements chimiotropes en raison de leurs effets secondaires sur les cellules non cancéreuses et de la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses peuvent causer plus de problèmes aux patients. Par conséquent, l'utilisation de composés naturels aux propriétés anticancéreuses élevées est devenue une solution supérieure10,13,35 . Des études ont montré que des fragments de pectine d'agrumes hydrolysés par voie enzymatique peuvent affecter la progression du cancer prolifératif de la prostate en réduisant le PSA sérique de 50 % après 14 mois de traitement. Il a été prouvé que les pectines d'agrumes et de pomme traitées par voie enzymatique peuvent inhiber la croissance et induire l'apoptose des cellules cancéreuses intestinales humaines19. La pectine de pomme modifiée de bas poids moléculaire inhibe le cycle cellulaire dans les tumeurs colorectales dans les cellules cancéreuses colorectales humaines (HT-29) in vitro et le cancer colorectal associé à la colite chez la souris36. La même pectine de pomme de faible poids moléculaire a réduit le risque de tumeurs cancéreuses du côlon chez la souris et s'est liée à la galactine-318. L'examen de la composition en monosaccharides a montré que l'acide galacturonique était le composant principal de la structure de la pectine modifiée et que seules de petites quantités de galactose y ont été trouvées, cependant, la composition en monosaccharides est similaire à celle des monosaccharides de pectasol. Bien que le MCP ne soit pas riche en galactooligo-saccharides, il peut être sélectivement absorbé dans l'intestin grêle par rapport aux acides oligo-galacturoniques37. Dans l'étude de Delphi et al. sur les cellules cancéreuses MDA-MB-231, le traitement par POS induit l'apoptose et réduit la survie des cellules cancéreuses38. Les résultats de la mesure de l'effet des oligosaccharides pectiques et des polysaccharides pectiques sur la lignée cellulaire cancéreuse HT29 par Li et al.39 ont montré que les POS sont plus efficaces pour inhiber les cellules cancéreuses à des concentrations beaucoup plus faibles que la pectine. Hosseini Abari et al.10 ont démontré une apoptose de 92 % de la lignée cellulaire MCF-7 après 24 h de traitement avec 20 mg/mL de POS, ce qui était significativement plus élevé que l'effet de la pectine à la même concentration. À l'appui des résultats précédents, notre étude a obtenu des oligosaccharides qui ont montré des propriétés anticancéreuses significatives pour les échantillons de P. polymyxa S4 et A. faecalis AGS3. À notre connaissance, il n'existe aucun rapport antérieur sur les propriétés antitumorales des produits des espèces P. polymyxa et A. faecalis.

Les effets de cytotoxicité des POS obtenus sur les cellules L-929 ont été déterminés après 48 h d'incubation par test MTT. Les cellules L-929 ont été traitées avec 5 et 40 mg/mL des produits obtenus et les cellules non traitées ont été utilisées comme contrôle. Comme mentionné sur la figure 7a, l'analyse n'a montré aucune toxicité significative pour A. faecalis AGS3 avec moins de 3 % de décès et P. polymyxa S4 avec environ 2 % de décès. La morphologie des cellules traitées, comme le montre la figure 7b, a confirmé les résultats du test MTT.

Évaluation de la cytotoxicité des POS obtenus sur les cellules L-929 après 48 h d'incubation. ( a ) Les résultats du test MTT des cellules traitées n'ont montré aucune cytotoxicité significative par rapport au contrôle. (b) L'analyse microscopique des cellules traitées n'a montré aucun changement dans la morphologie des cellules par rapport au témoin.

La cytotoxicité des médicaments utilisés dans le traitement du cancer sur les cellules non cancéreuses est une préoccupation majeure dans les traitements chimiotropes. Contrairement aux résultats précédents de Delphi et al. qui a montré une toxicité à des concentrations élevées de POS sur des cellules HUVEC, dans la présente étude après 48 h de traitement de cellules L-929 avec 40 mg/mL de POS, aucune toxicité significative n'a été observée38. Selon nos informations, aucune autre étude n'a étudié la cytotoxicité des POS obtenus à partir d'A. faecalis et de P. polymyxa.

À la suite de cette étude, deux nouveaux isolats bactériens, Alcaligenes faecalis AGS3 et Paenibacillus polymyxa S4 ont été isolés et identifiés. Les isolats mentionnés étaient capables de dégrader la pectine en une gamme d'oligosaccharides pectiques insaturés. Dans cette étude, pour la première fois, la bioactivité des composés obtenus à partir de l'activité pectinolytique des espèces A. faecalis et P. polymyxa a été étudiée, et les résultats ont montré des propriétés antioxydantes et anticancéreuses significativement plus élevées malgré leur non-toxicité pour les cellules vivantes. La bioactivité exquise des composés obtenus, ainsi que la capacité d'éliminer les déchets de fruits de l'environnement, en font une excellente solution économique et environnementale à un problème croissant dans le monde.

Les déchets du cultivar de pomme Golden Delicious (Malus domestica) ont été utilisés dans cette étude. Les déchets mentionnés ont été achetés au marché aux fruits local de la fruiterie Bahar, Ispahan, province d'Ispahan, Iran. Les pommes ont été pelées et coupées en cubes de 3 mm, puis 30 g des déchets de pommes hachées ont été ajoutés à une solution composée de jus de citron (12,5 ml), d'acide citrique (0,1 g) et de 150 ml d'eau distillée. Le mélange a été bouilli sur le radiateur pendant 30 min puis filtré à travers un tissu de coton. Après refroidissement à température ambiante, 30 ml d'alcool éthylique à 96% ont été ajoutés à la solution filtrée, puis mis à 4 ° C pendant une heure pour obtenir une forme gélifiante. Le surnageant du mélange a été jeté après centrifugation pendant 10 min à 800 g. Au final, le sédiment qui contenait la pectine extraite a été lyophilisé40.

Des échantillons de sol ont été prélevés dans 12 zones différentes comme source d'isolement. Les échantillons ont été dissous et bien mélangés pendant une heure dans une solution de Ringer, puis cultivés dans un milieu de gélose nutritive contenant 0,25 ml de clotrimazole à 1 % dans 100 ml d'eau distillée. Les isolats sélectionnés ont ensuite été cultivés dans un milieu pectin agar contenant de la pectine extraite (0,5 g), de l'extrait de levure (0,1 g), de la peptone de caséine (0,5 g), du CaCl2 (0,2 g), du NaCl (0,2 g) et de l'agar (1,5 g) dans 100 mL d'eau distillée41. Après 24 h à 30 °C, les colonies dégradant la pectine ont été différenciées par la mesure de leur zone de halo clair à la suite de l'ajout d'une solution de réactif I/KI à 1 % aux plaques42. Les isolats AGS3 du sol de jardin et S4 du sol de forêt ont été sélectionnés et identifiés. Les paires d'amorces universelles, 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) et 1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) ont été utilisées comme amorces directes et inverses respectivement pour amplifier le gène d'ARNr 16S, puis la procédure de séquençage a été réalisée par Bio Magic Gene (BMG) Company, Chine. Les séquences ont été soumises à GenBank, NCBI, et l'historique des relations évolutives a été étudié à l'aide de la méthode de l'arbre de vraisemblance maximale dans le logiciel MEGA 11. La séquence d'ADNr 16S de la souche YS4 de Streptomyces maltophilia a été utilisée comme groupe externe (MT071635.1).

La dégradation de la pectine a été déterminée, en utilisant l'analyse quantitative des sucres réducteurs par l'acide 3,5-dinitrosalicylique (méthode DNS). Après inoculation d'isolats bactériens dans le milieu de bouillon de pectine contenant de la pectine extraite (0,5 g), de l'extrait de levure (0,1 g), de la peptone de caséine (0,5 g), du CaCl2 (0,2 g) et du NaCl (0,2 g) dans 100 ml d'eau distillée , 4 ml de milieu bactérien ont été extraits dans des conditions stériles toutes les deux heures. Ensuite, la masse bactérienne a été séparée du milieu par centrifugation à 2400 g pendant 5 min. Un 1 ml de réactif DNS a été ajouté à un tube à bouchon vissé contenant le surnageant de culture, et les tubes de réaction ont été bouillis pendant 5 min et refroidis à température ambiante. Un 1 ml de sulfate de sodium à 0,5% a été ajouté aux tubes à essai pour obtenir une couleur stable et les valeurs d'absorbance ont été lues à 540 nm43.

La chromatographie sur couche mince (TLC) a été utilisée pour détecter les produits de dégradation de la pectine. 1,5 μL des surnageants de culture comme échantillon, une solution 1 mM d'acides mono-galacturoniques et une solution 1 mM de glucose comme solutions standard (achetées auprès de Sigma) ont été déposés sur du gel de silice 60 F254 (Merck). La chromatographie a été effectuée trois fois dans du n-butanol/acide acétique/eau (2:1:2) en tant que phase mobile. La visualisation des taches séchées sur du gel de silice a été réalisée en pulvérisant un réactif orcinol/acide sulfurique (8 mg d'orcinol dans 10 mL d'acide sulfurique à 70 %). Ensuite, les plaques ont été chauffées à 100 °C pendant 10 min32.

Les produits de dégradation de la pectine obtenus ont été analysés et identifiés par LC-ESI-MS. 2 mg de chaque échantillon ont été dissous dans 100 μL d'eau distillée et la fraction soluble des échantillons a été étudiée. L'étude a été réalisée de manière isocratique par un mélange d'eau et d'acétonitrile (90:30) en tant que phase mobile et le débit a été réglé à 0,3 mL/min. Un système LC Agilent série 1100 composé d'une pompe d'alimentation quaternaire, d'un compartiment à colonne thermostaté, d'un dégazeur (Agilent Technologies, Allemagne) et d'une vanne d'injection manuelle Rheodyne 7725i avec une boucle d'échantillon de 20 µL (Cotati, CA, USA) a été utilisé pour préparer un échantillon et la spectrométrie de masse a été réalisée avec le spectromètre de masse Agilent 6410 Triple Quadripôle (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) qui était géré par Agilent MassHunter Workstation B.01.03. L'ionisation a été obtenue en utilisant l'ionisation par électropulvérisation (ESI) en mode négatif avec une tension capillaire de 4000 V. L'azote a été utilisé comme gaz de nébulisation avec une pression de nébulisation de 40 psi et une température de source de 100 °C. L'azote a été chauffé à 300 °C et délivré à un débit de 10 L/min. La tension de fragment pour les échantillons était de 280 V et le temps de séjour était de 200 ms. L'analyte a été détecté à l'aide du mode balayage32.

Les effets antioxydants des oligo-saccharides pectiques obtenus ont été évalués à diverses concentrations allant de 1,25 à 80 mg/mL. 0,5 ml de POS a été ajouté à 2 ml de solution méthanolique 0,2 mM de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Les tubes de réaction ont été placés pendant 30 min à 25°C dans l'obscurité. Ensuite, l'absorbance des échantillons a été examinée à 517 nm. Le témoin de la réaction était du DPPH 0,2 mM et de l'éthanol à 60 % a été utilisé comme blanc. Sur la base de l'absorbance mesurée, l'activité de piégeage des radicaux (RSA) a été calculée par Eq. (1)44 :

La lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein humain (acquise auprès de la banque de cellules de l'Université d'Ispahan) a été cultivée dans un milieu COM composé du milieu minimal d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; BioIdea), avec 10 % de sérum bovin fœtal (BioIdea) et 1 % de pénicilline –solution de streptomycine (Sigma, USA)45.

Le test MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromure) a été utilisé pour analyser la viabilité cellulaire. Les cellules ont été étalées dans des plaques de culture à 96 puits à une densité de 10 000 cellules par puits et incubés dans un incubateur à CO2 à 37 °C dans 5 % de CO2 et 95 % d'humidité pendant 24 h. Le lendemain, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7), traitées avec 5 et 40 mg/mL concentration de pectine et obtenu POS pendant 24 et 48 h En outre, à des moments respectifs, 20 μL de solution MTT (5 mg / ml) ont été ajoutés aux puits et les cellules ont été incubées dans un incubateur à CO2 dans l'obscurité pendant 4 h. Le milieu a été retiré et les cristaux de Formazan formés par les cellules ont été dissous à l'aide de 100 µl de diméthylsulfoxyde (DMSO).La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un lecteur multimode à 570 nm et calculée comme l'équation (2)46 :

Les cellules ont été récoltées sur des plaques de culture à 24 puits à une densité de 100 000 cellules par puits et incubées dans un incubateur à CO2 pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du PBS et traitées avec des concentrations de 5 et 40 mg/mL de POS obtenu pendant 24 et 48 h. Désormais, l'iodure de propidium (PI, Sigma) est utilisé pour la détection des cellules immortalisées. Les cellules ont été évaluées à l'aide d'un cytomètre en flux (Becton Dickinson FACS Calibur) et la distribution des cellules a été analysée à l'aide du logiciel CellQuest47.

Des cellules de fibroblastes de souris L-929 ont été cultivées dans du milieu COM et étalées sur des plaques de culture à 96 puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées en utilisant une concentration de 5 et 40 mg/mL de POS obtenu pendant 24 et 48 h. Ensuite, le test MTT tel que mentionné a été effectué pour analyser les effets de cytotoxicité des composés obtenus46.

Toutes les données analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers de matériaux supplémentaires.

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Les auteurs sont reconnaissants à l'Université d'Ispahan pour le soutien financier accordé à l'étudiant MS pour une période de formation au Département de biologie cellulaire et moléculaire et de microbiologie, Université d'Isfahan.

Département de biologie cellulaire et moléculaire et de microbiologie, Faculté des sciences et technologies biologiques, Université d'Ispahan, Isfahan, 8174673441, Iran

Behnam Ashrafian & Afrouzossadat Hosseini-Abari

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BA : conservation des données ; Analyse formelle ; Enquête; En écrivant. AHA : Supervision ; Méthodologie, rédaction—révision et édition.

Correspondance à Afrouzossadat Hosseini-Abari.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ashrafian, B., Hosseini-Abari, A. Enquête sur la bioactivité des acides oligo-galacturoniques insaturés produits à partir de déchets de pomme par Alcaligenes faecalis AGS3 et Paenibacillus polymyxa S4 Pectinases. Sci Rep 12, 15830 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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Reçu : 09 juillet 2022

Accepté : 07 septembre 2022

Publié: 22 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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